這篇文章研究了天然抗癌藥物候選物綠原酸的直接蛋白質(zhì)靶點和抗癌分子機制。
研究背景
1、綠原酸是一種天然產(chǎn)物,已被證明在許多臨床前模型中有效抑制腫瘤生長,并在中國進行了膠質(zhì)瘤患者的II期臨床試驗。然而,CGA的直接蛋白質(zhì)靶點和抗癌分子機制仍然未知。
2、確定綠原酸的直接蛋白質(zhì)靶點具有挑戰(zhàn)性,因為許多天然產(chǎn)物通過非共價結(jié)合與其靶點相互作用,傳統(tǒng)的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法難以捕捉這些相互作用。
3、活動性基于探針的蛋白質(zhì)組學(xué)(ABPP)是一種結(jié)合了活動性探針(ABP)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的方法,用于識別生物活性天然產(chǎn)物的蛋白質(zhì)靶點,以幫助闡明其作用模式和副作用。
研究方法
1、設(shè)計并合成了一種新型的雙功能光親和探針PAL-綠原酸,基于綠原酸的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR),包含了光親和性和富集手柄。
2、使用親和性蛋白質(zhì)組學(xué)(AfBPP)化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法,通過多種檢測手段(如表面等離子共振(SPR)、等溫滴定量熱法(ITC)和冷凍電子顯微鏡(cryo-EM))對ACAT1/綠原酸相互作用進行了深入研究。
3、具體步驟包括:使用Sephadex G-200尺寸排阻柱和HiTrap™ Q HP陰離子交換柱對蛋白質(zhì)進行純化和脫鹽,使用Thermo Fisher Titan Krios G3i電子顯微鏡進行cryo-EM單顆粒分析,使用Biacore T200系統(tǒng)進行SPR分析,以及使用EAQ-ITC儀器進行ITC分析。
實驗設(shè)計
1、通過MTT法評估綠原酸對A375細胞的細胞毒性,細胞在96孔板中以1×10^4細胞/mL的密度接種,在5% CO2條件下孵育12小時,然后在缺氧條件下以1.25-10 mmol/L的綠原酸濃度處理72小時。
2、使用HisTrap HP柱進行親和色譜純化ACAT1蛋白,并通過SDS-PAGE確認其純度。
3、通過熱位移試驗(TSA)和藥物親和響應(yīng)靶穩(wěn)定性(DARTS)試驗評估綠原酸與ACAT1的結(jié)合穩(wěn)定性和親和力。
4、使用cryo-EM單顆粒分析研究ACAT1/綠原酸復(fù)合物的結(jié)構(gòu),數(shù)據(jù)在Thermo Fisher Titan Krios G3i電子顯微鏡上收集,使用MotionCor2進行圖像對齊和求和,使用CTFFIND4.1進行CTF估計,使用RELION3.1進行粒子挑選和分類。
結(jié)果與分析
1、綠原酸通過抑制ACAT1四聚體在Y407殘基上的磷酸化,從而抑制癌細胞增殖。
2、SPR分析顯示綠原酸與ACAT1的平衡解離常數(shù)(KD)約為2.58 mmol/L。
3、ITC數(shù)據(jù)顯示綠原酸與ACAT1的結(jié)合具有兩個位點,第一個位點的KD為9.68 mmol/L,第二個位點的KD為39.7 mmol/L。
4、cryo-EM結(jié)構(gòu)顯示綠原酸通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定地結(jié)合在ACAT1的四聚體上,綠原酸的咖啡酸部分暴露在ACAT1結(jié)構(gòu)的外部,而奎寧酸部分位于變構(gòu)位點。
5、在體外和體內(nèi)實驗中,綠原酸顯著抑制了ACAT1的活性,減少了Y407的磷酸化,增加了丙酮酸脫氫酶(PDH)的活性,從而抑制了腫瘤生長。
總體結(jié)論
1、使用新型雙功能光親和探針PAL/綠原酸和AfBPP化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法,首次發(fā)現(xiàn)線粒體ACAT1是綠原酸的主要靶蛋白。
2、綠原酸通過非共價結(jié)合ACAT1四聚體,誘導(dǎo)廣泛的構(gòu)象變化,導(dǎo)致Y407磷酸化的消除,從而降低ACAT1活性。
3、這種新的作用模式解釋了綠原酸的臨床益處,并為未來的臨床應(yīng)用提供了新的見解。
這篇文章通過詳細的實驗設(shè)計和多種生物化學(xué)技術(shù),揭示了綠原酸作為ACAT1抑制劑的分子機制,為綠原酸在癌癥治療中的應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ)。